PCR と HTS の統合アプローチを適用して家禽生産におけるすべてのサルモネラ血清型をモニタリング

Jul 26, 2023

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サルモネラ感染症は、食中毒の最も一般的に報告されている原因の 1 つであり、世界中で毎年 8,000 万件以上の食中毒が発生しています。 ほとんどの病気は、下痢、発熱、腹痛などの胃腸症状を特徴とし、障害や死につながるより重篤な病気もあります。1 サルモネラ菌汚染は多くの種類の食品で見つかっていますが、家禽および肉や卵などの家禽製品は、非腸チフス性サルモネラ菌の主な感染源であることがよく知られています。 野鳥はサルモネラ菌を保有していることが多く、鳥の間や鶏舎内の塵や綿毛の空中移動を介して簡単に感染します。 15 か国の 157 件の研究を統合した全体的な有病率に基づくと、サルモネラ菌は鳥の約 18 パーセント、製品の 22 パーセント、環境サンプルの 29 パーセント以上で検出されています。2 米国疾病管理予防センター (CDC) は、スーパーで売られている鶏肉 25 パックごとにサルモネラ菌に汚染されています。

サルモネラ菌は 2,600 を超える血清型で構成されており、それぞれの有病率、感染経路、病原性の可能性が異なります。 一部の血清型はヒトの病気と関連していることが多いですが、関連していない血清型も多くあります。 たとえば、15 か国で実施された 157 の研究から合計 131 の血清型が同定され、サルモネラ ハイデルベルク、ケンタッキー、腸炎菌、ネズミチフス菌は家禽サンプルで最も蔓延しており、抗菌薬耐性の蔓延が最も高い菌類の 1 つです。2これらの血清型（特にサルモネラ・エンテリティディスとネズミチフス菌）は多数の流行の原因となっていますが、他の多くの血清型も流行に関連しています。 サルモネラ菌血清型の流行率も場所や時間の経過とともに変化します。 カナダのオンタリオ州全域の192の養鶏場を対象とした著者らの最近の研究では、以前は高い蔓延を示していたサルモネラ・ハイデルベルクが大幅に減少した3。その結果、効果的な対策を実施するために完全な疫学的状況を確立するには、すべての血清型をモニタリングすることが重要である。養鶏場から消費者の食卓へのサルモネラ菌の感染を防ぎます。

サルモネラ菌の主な感染媒体の 1 つは、サルモネラ菌に汚染された卵および卵由来製品です。 この細菌は家禽の生殖器官に侵入し、卵の内容物を汚染する可能性があります4。その結果、多くの国の規制当局は、汚染された可能性のある鶏群を特定して人口を削減し、汚染された卵を防止するために、サルモネラ・エンテリティディスを検出するための環境衛生監視プログラムを確立しました。市場に到達するまでに。

ただし、他の血清型が卵殻の汚染に関与している可能性があることに注意することが重要です。 たとえば、2015 年にはサルモネラ・オラニエンブルグに汚染された卵が原因で 6 つの州で 52 件の病気が報告されました。 さらに、2018年には10州の消費者45人がサルモネラ・ブレンダップに感染し、全米で11人が入院し、2億700万個の卵がリコールされた オーストラリアの41の農場から採取された卵の殻からは、ネズミチフス菌やインディアナなど他の血清型も検出された.5 多くの研究では、昆虫や動物が家禽へのサルモネラ菌の侵入の媒介者として機能する可能性があることも示唆されています。6,7,8 その結果、いくつかの管轄区域では、卵を市場に出す前に洗浄（消毒）して、感染を軽減する必要があります。卵殻汚染のリスク。 さらに、サルモネラ・ガリナルムやプルロールムなどの特定の血清型による卵層の感染は、卵の生産に影響を及ぼし、群れの高い死亡率を引き起こす可能性があります9。ネズミチフス菌は、卵管の変性を引き起こし、食料生産に悪影響を及ぼす可能性のある病変を引き起こす可能性もあります10。

現在の監視および規制プログラムは一般に、さまざまなサンプリング手法を特徴としており、主に規制執行のために文化的に確認された結果に依存しています。 たとえば、カナダでは、カナダ食品検査庁 (CFIA) が養鶏産業向けに全国的なサルモネラ・エンテリティディス管理プログラムを実施しています。 CFIA とカナダ鶏卵産業互恵同盟 (CEIRA) がカバーするサルモネラ・エンテリティディス保険はどちらも、サルモネラ・エンテリティディス検査結果が陽性で個体数が減少した鶏の保険を請求するには、確認された培養結果が必要です。

米国では、農務省 (USDA) と食品医薬品局 (FDA) が、家禽におけるサルモネラ菌の蔓延を制御するためのガイドラインと具体的な対策を含む国家家禽改善計画 (NPIP) を策定しています。 この計画は任意ですが、ほとんどの生産者は取引目的で参加することを選択しています。 NPIP はまた、新しい診断技術を全国の家禽および家禽製品の改善に効果的に適用できる、産業界、州、および連邦の協力プログラムも提供しています。 NPIP は、子猫の 80% 近くの死亡率を引き起こしたサルモネラ プルロールムの蔓延を抑制するために 1930 年代に開始されました。 このプログラムは後に、サルモネラ・エンテリティディスを含む他の血清型のモニタリングを含むように拡張されました。 NPIP は 12 の迅速検出法を承認または暫定承認しており、そのうち 3 つはサルモネラ菌に焦点を当てており、残りの方法はサルモネラ属菌の検出に焦点を当てています。 血清型を決定するには培養分離が必要です。

2022年10月、USDAの食品安全検査局（FSIS）は、家禽製品中のサルモネラ菌汚染を削減するための規制枠組み案を発表した。 FSIS は、施設がサルモネラ菌を危険源として考慮し、危険分析重要管理点 (HACCP) 計画の一環として受け入れ時にサルモネラ菌に対処する必要があるかどうかを評価しています。 さらに、この提案では、施設がサルモネラ菌のレベルを監視するか、流入する群れの血清型を判定することが求められます。 この提案された戦略の下では、施設はサプライヤーや請負業者と協力して、飼育施設、孵化場、育成場、輸送全体でサルモネラ菌を減らすためのベストプラクティスを確実に実施する必要があります。 しかし、削減目標を達成するための戦略を実施するための具体的または追加のルール、政策、方法論、プロトコルはまだ最終決定されていません。

サルモネラ菌検出の標準的な方法には、緩衝ペプトン水 (BPW) などの非選択培地でのサンプルの事前濃縮が含まれます。 次に、プレ濃縮物は、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) スクリーニングまたは Rappaport Vasiliadis Soy ブロス (RVS) やテトラチオン酸ブリリアント グリーン ブロス (TBG) などの選択培地での二次濃縮に供され、続いて亜硫酸ビスマスなどの選択寒天上にプレーティングされます。 (BS)、ブリリアント グリーン スルファピリジン (BGS) 寒天、およびキシロースリジン デオキシコール酸 (XLD) 寒天。 サルモネラ菌の形態学的特徴を持つ疑わしいコロニーは、生化学反応によって確認されます。 サンプルから確認されたコロニーは、カウフマン・ホワイトスキーム 11 に従って抗体と抗原の相互作用に基づいて参照検査室で血清型が特定され、または全ゲノム配列決定 (WGS) がその血清型を決定するために使用されます。

培養方法には複数のステップが含まれており、完了するまでに数日かかり、実行および解釈には熟練した技術者が必要です。 現在のアプローチは統計的にサンプル中に最も豊富なサルモネラ血清型の検出に有利であり、公衆衛生にとって依然として重要な可能性がある、それほど豊富ではないサルモネラ血清型を見逃します。 この矛盾により、疫学全体像が部分的で混乱し、予防および介入の実践の有効性が損なわれます。 理論的には、培養プレートからより多くのコロニーを検査すると、複数の血清型の検出が可能になります。 しかし、コロニー数の増加に伴い検査にかかる費用と労力が増加するため、これは実際には法外な方法です。

さらに、RVS や TBG ブロスなどのさまざまな選択培地での濃縮は、特定のサルモネラ血清型の偏った検出につながる可能性があります。12,13 この問題は、サルモネラ エンテリティディスなどの特定の血清型を同定するために検査が必要な場合にさらに深刻になります。 培養バイアスがサンプル中のすべてのサルモネラ菌株を正確に同定する確率に及ぼす影響を完全に解明するには研究はまだ限られています 14,15。 従来の培養ベースの血清型判定法では、O (体細胞性) と H (鞭毛）表面抗原はカウフマン・ホワイトスキームに基づいており、リソースと技術的スキルの要件が厳しいため、主に参考研究室で行われます。 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) ベースの方法は、培養分離を行わずに血清型を検出するために使用できますが、一度に検出できる血清型の数はあらかじめ決められた限られた数に限られます。16 WGS アプローチには依然として培養分離が含まれており、主に以下の分野で使用されています。病原体のサブタイピングのための公衆衛生研究所。17、18、19

標的となる同一領域の増幅に基づくハイスループット シーケンシング (HTS) 技術の適用により、多様な集団を含むサンプルのプロファイリングが可能になります。 PCR プライマーは、サンプル内のすべての標的微生物から目的の領域を増幅するために使用され、識別目的で純粋培養物を単離する必要がなくなります。 HTS に続いて、堅牢なデータ分析ツールを使用して配列を分類し、既知の分類群に同一性を割り当てます。これにより、サンプル中の目的の生物の検出が容易になり、相対存在量情報も提供されます。 PCR および HTS を使用すると、すべてのサルモネラ菌に含まれる同一領域を配列決定することにより、サンプル中に存在するすべてのサルモネラ血清型をプロファイリングできるため、サルモネラ菌の検出および血清型別の標準的な培養法で必要とされるさらなる濃縮および単離ステップの必要性を回避できます。ゲノム。

サルモネラ菌のゲノムには、血清型を区別するために使用できるクラスター化規則的に間隔をあけた短い回文反復 (CRISPR) 配列が含まれています。 最近報告された CRISPR-SeroSeq (配列決定による血清型判定) と呼ばれる方法では、HTS を利用して、サルモネラ ゲノム内の CRISPR 遺伝子座を含む定義された領域を標的とすることにより、サンプル中のサルモネラ血清型をプロファイリングします 20。 直接反復領域は保存され、PCR の隣接配列として使用されます。増幅。 公的に入手可能なサルモネラ菌 CRISPR 配列を使用してデータベースを構築し、インデックス付き PCR アンプリコンの HTS で生成された未知のサンプル配列にサルモネラ血清型の同一性を割り当てます。 特定のサルモネラ血清型に割り当てられた配列の数により、混合集団に存在する主な血清型とそれほど豊富ではない血清型の両方を含む、個々のサンプル中の複数のサルモネラ血清型の相対存在量の検出と計算の両方が可能になります。 CRISPR-SeroSeq メソッドは、家禽の環境サンプルを使用して検証されたように、PCR と同様の検出感度と再現性を持つことが実証されています。 また、一般的なサルモネラ血清型を同時に検出することもでき、混合サルモネラ集団では少数の血清型が 0.01% という低い量で検出されます。3

CRISPR-SeroSeq を使用してサルモネラ血清型集団のプロファイリングを行うと、Siceloff らによって行われた最近の研究で実証されているように、家禽生産のさまざまな段階で検出されるサルモネラ血清型の変化をより完全に把握し、より深く理解できるようになります。21 この研究により、サルモネラ菌が明らかになりました。米国における2016年から2020年のブロイラーの枝肉と鶏肉の生部分における血清型の流行を調査し、サルモネラ血清型の地域差を特定し、大西洋と南東部の地域では、中南、中西部、山間部、西部の地域に比べてネズミチフス菌の分離頻度が高かった。

生産のさまざまな段階での監視データからは、地域を越えて、サルモネラ・ケンタッキーが枝肉から鶏肉の生部分までのサンプル内で相対的な割合で減少しているのに対し、サルモネラ・エンテリティディスは逆の傾向があることも明らかになりました。 ジョージア州では、サルモネラ・ケンタッキーの分離が2016年から2020年にかけて屠体サンプルで増加しただけでなく、生後15～19週および40～45週の繁殖群から採取されたサンプルでも最も頻繁に分離された血清型でした。 Salmonella Enteritidis、Typhimurium、バリアント I 1,4,[5],12:i:-、Infantis、Schwarzengrund などの他の血清型は、ブリーダーのサンプルではそれほど頻繁には検出されませんでしたが、後の処理中に採取されたサンプルでは検出されました。 著者らは、加工中のサルモネラ菌の減少を目的としたプロセスは、サルモネラ・ケンタッキーの減少には効果的であるが、繁殖鶏群に存在する他の血清型の減少には効果が低く、これらの血清型は、主要な血清型のみの培養選択における制限により検出されなかったと考えている。

また、Siceloff ら 21 は、CRISPR-SeroSeq を適用して、2020 年から 2021 年にかけてジョージア州の家禽サンプルにおける複数のサルモネラ血清型の蔓延を調査し、検査した 134 サンプルの中でサルモネラ・ケンタッキーが最も一般的であることを発見し、これは監視結果と一致しています。 しかし、CRISPR-SeroSeq アプローチでは、次に多い血清型としてサルモネラ セロとサルモネラ ムバンダカ、さらに血清型のサルモネラ エンテリティディス、インファンティス、モンテビデオ、トンプソン、およびネズミチフス菌も特定されました。 特に、サルモネラ・インファンティスは 12 のサンプルで検出されました。 これらのうち 11 件では、それは少数派の血清型でした (優勢な血清型に次いで 2 番目に多い血清型)。 著者らは、この結果は、サルモネラ血清型の減少を目的とした抗菌介入が、同定された優勢な血清型に対して効果的であったことを示唆していると指摘している。 しかし、繁殖群れに存在するサルモネラ血清型の全体像が不足しているため、少数の血清型が抗菌薬軽減戦略を回避する機会が生じています。

CRISPR-SeroSeq 法の応用の成功は、カナダのオンタリオ州全域の養鶏場でサルモネラ菌血清型を調査するために行われた大規模研究でも実証されました。3 CRISPR-SeroSeq 法は、サルモネラ陽性 442 例の分析に使用されました。 PCR) 環境サンプルを 192 の養鶏場から収集し、農場のサルモネラ血清型の全体像を明らかにしました。 サンプルは、換気扇 (n = 178)、卵ベルト (n = 96)、肥料ベルト (n = 87)、床 (n = 37) およびその他の場所 (n = 44) から 10 か月間にわたって採取されました。 430 のサンプルから合計 25 の血清型が検出され、サンプルの 73.1% には 1 つのサンプルに複数 (最大 7 つ) の血清型が含まれていました。 農場で最も多く確認された血清型は、サルモネラ・キアンブ（55.7パーセント）、インファンティス（48.4パーセント）、ケンタッキー州（27.1パーセント）、リビングストン（26.6パーセント）、ムバンダカ/モンテビデオ（23.4パーセント）でした。 さまざまな血清型が、州全体の 10 の生産者地理的ゾーンに分布していました (図 1)。

サルモネラ・キアンブとインファンティスは、さまざまな地理的ゾーンで最も一般的でした。 サルモネラ・リッセンは、南部地域と比較して北部地域でより頻繁に検出されました。 限られた数の農場の検査に基づいてサンプリングされたすべての表面タイプから 1 ～ 2 つの共通の血清型が検出されましたが、農場内では、異なるサンプリング表面に異なる血清型が存在することが判明しました。 換気扇サンプルでは、​​全体の平均 (2.4) と比較して、サンプルごとに検出された血清型の平均数 (2.7) が増加しました。 暖かい季節（6 月〜10 月）ではより多くの血清型が検出され、寒い季節（11 月〜3 月）の平均 2.1 個の血清型と比較して、サンプルあたり平均 2.6 個の血清型が検出されました。 全体として、CRISPR-SeroSeq メソッドは、従来の培養法で検出されたものよりも平均して 3.3 倍の頻度でサルモネラ血清型を検出しました。 従来の方法で血清型判定された 384 サンプルのうち 616 例では、CRISPR-SeroSeq によって検出された血清型が、培養によって同じサンプルから検出されませんでした。 これには、鶏卵農場にとって懸念される主な血清型であるサルモネラ・エンテリティディスが含まれており、この菌はCRISPR-SeroSeqによって検出され、10か月間検査された5,392の環境サンプル中から検出された3回のうちの1回で培養により見逃された。

オンタリオ州の研究で CRISPR-SeroSeq によって検出された最も一般的なサルモネラ血清型 (キアンブ、インファンティス、ケンタッキー、リヴィングストン、ムバンダカ/モンテビデオ) は、以前に報告されているように、主要な血清型の重大な変化を反映しています。 2002 年から 2003 年にかけてオンタリオ州で行われた産卵場と子持ち養殖場に関する研究では、最も一般的な血清型としてサルモネラ菌ハイデルベルク、ネズミチフス菌、トンプソン、シュワルツェングルント、およびアゴナが特定されました。22 2009 年から 2010 年にかけてオンタリオ州で行われた採卵場と子持ち養殖場の操業に関するその後の研究でも再び行われました。 2009 年から 2018 年にかけてオンタリオ州の養鶏場から採取された綿毛サンプルのより最近の経時的研究では、サルモネラ ケンタッキー、エンテロティディス、ハイデルベルク、および最も頻繁に分離される血清型として Senftenberg が挙げられます。24

最も重要な変化の 1 つはサルモネラ ハイデルベルクであり、以前の研究では高い有病率が示されましたが、著者らの最近の研究ではわずか 5% の農場で検出されました。もう 1 つの重要な変化は、サルモネラ キアンブです。これは、CRISPR-SeroSeq によって最も頻繁に検出される血清型であり、オンタリオ州の養鶏場での培養によって 3 番目に頻繁に検出される血清型として浮上しました 3 が、以前は過小報告されていました。 サルモネラ・キアンブは、米国における2017年のサルモネラ感染発生の23.5パーセント（213人中50人）に関与していると考えられているため、この発生は特に懸念される25。サルモネラ・リッセンは、著者らの研究におけるもう1つの新興血清型であり、農場での検出率は21パーセントを超えていた。 CRISPR-SeroSeq によって検出されたが、培養により検出された農場はわずか 1% でした。3 サルモネラ・リッセンは、さまざまな地域のヒトの間で過小報告されている新興の血清型としても認識されているため、以前または培養によるサルモネラ・リッセンの大幅な過小評価が懸念されています。国.26

多数の PCR 法と検証済みの CRISPR-SeroSeq 法が利用できるようになったことで、培養物を分離せずにサルモネラ菌血清型を検出し、養鶏場や生産施設における現在のサルモネラ菌モニタリングプログラムを改善することが可能になりました。 全体的な試験アプローチを図 2 に示します。家禽の環境サンプルは、まず緩衝ペプトン水 (BPW) で 18 ～ 24 時間、事前に濃縮されます。 次に、プレエンリッチメントをリアルタイム PCR にかけてサルモネラ菌の存在をスクリーニングします。 PCR 陽性サンプルは CRISPR-SeroSeq によって分析され、サンプルに含まれるサルモネラ血清型が特定されます。 CRISPR-SeroSeq は、PCR 陽性サンプルの DNA 抽出物から 36 ～ 48 時間以内に血清型の結果を提供できます。 培養確認が必要な場合（例：サルモネラ・エンテリティディスなどの重要な血清型の検出時、または発生調査のため）、PCR 陽性のプレ濃縮物を免疫磁気分離（IMS）に供し、磁気ビーズを使用して標的細胞を濃縮することができます。サルモネラ菌種、またはサルモネラ菌の選択されたサブグループ（グループ D など）に特異的な抗体と共有結合します。 次に、サルモネラ細胞濃縮物は、RVS、TBG、またはその他の選択培地などの二次選択培地で 18 ～ 24 時間濃縮されます。 二次濃縮物を CRISPR-SeroSeq に供してサルモネラ血清型を同定したり、選択寒天上にプレーティングすることにより培養単離に供したりすることもできます。 疑わしいサルモネラ菌コロニーは、生化学反応または PCR によって確認されます。 確認されたコロニーは、伝統的にまたはWGSによって血清型別されます。 この場合、すべてのサルモネラ血清型またはそれほど豊富ではない血清型を培養的に確認する必要がある場合、検出率を高めるために、各推定サルモネラ陽性プレートから多数の標的コロニーを検査する必要があります。

サルモネラ菌の発生、家禽の病気、さまざまなサルモネラ血清型に関連した家禽製品の汚染事象により、家禽生産チェーンにおけるすべての血清型を監視する必要性が強調されています。 このモニタリングは、血清型の動態と新たな血清型についての洞察を得るのに役立ち、重大な懸念のある血清型を確実に検出して軽減策の改善に役立ちます。 養鶏場からの環境サンプルは、最終的な発生源であるサルモネラ菌の群れの存在を容易に明らかにすることがよくあります。

迅速 PCR スクリーニング法は、検出目的で容易に利用できます。 高度なメタゲノミクスツールを介してすべてのサルモネラ菌血清型を日常的に検出することは、現時点では限られた数の食品安全検査機関で技術的に実現可能です。 提案された規制枠組みの変更、特定のガイドライン、プロトコルが定義された後、監視プログラムで利用可能な技術やツールの導入を増やすことは、家禽製品に関連するサルモネラ感染症の減少に役立つと期待されています。

Shu Chen 博士は、グエルフ大学食品科学部農業食品研究所の上級研究員兼分析生物学ユニットのマネージャーです。

カルロス・レオン・ヴェラルデ博士は、グエルフ大学食品科学部農業食品研究所の食品微生物学ユニットの監督者です。

Nicola Linton 博士は、グエルフ大学食品科学部農業食品研究所分子生物学ユニットの分子アッセイ開発科学者です。